Методы окраски в микробиологии
творческая технология
базовые понятия
Окраска препаратов в микробиологии — это комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов. Она позволяет различать виды микроорганизмов и определять их форму, размеры, строение, локализацию и взаимное расположение.

Существует два основных типа окраски: витальный и поствитальный. Витальный способ используется для прижизненного окрашивания микроорганизмов, например, спирохет и простейших. Поствитальный способ применяется для окрашенных фиксированных препаратов и включает простые и сложные методы
Витальный способ окраски
Используется 0,2–0,001% водные растворы метиленового и толуидинового синего, нейтральротаи конго красного. Этот способ применяется для выявленияспирохет, простейших, а также подвижности бактерий

постВитальные способы окраски
Делятся на простые исложные.
Простые способы включают нанесение на фиксированный препарат красящих растворов фуксина Пфейффера (экспозиция 1–2 минуты) или щелочного метиленового синего (3–5 минут).

Сложные способы используются для определения структуры микробов и ихдифференцированного отношения к красителям

ПОСТВИТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ ОКРАСКИ
СЛОЖНОГО ТИПА
рассмотрим три основных метода окраски
МЕТОД ГРАМА
Является важным диагностическим методом. Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные - темно-фиолетового цвета и грамотрицательные - красного. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клеточной стенки и коррелирует со многими другими свойствами бактерий. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Фуксин докрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет
МЕТОД ЦИЛЯ-НЕЛЬСОНА
Применяется для дифференциации кислотоустойчивых бактерий от кислотоподатливых. После окраски карбол-фуксином и обработки серной кислотой, кислотоустойчивые бактерии сохраняют красный цвет, а кислотоподатливые обесцвечиваются
МЕТОД РОМАНОВСКОГО-ГИМЗЫ

При окрашивании по методу Романовского-Гимзы ацидофильные структуры приобретают различные оттенки красного цвета, а базофильные-цвета от пурпурного до синего. Это позволяет детально изучить морфологию микроорганизмов и других клеточных структур

МЕТОД ОЖЕШКО
Сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители
МЕТОД НЕЙССЕРА
Используется для выявления зерен волютина. Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим, при этом происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем докрашивается везувином в желто-коричневый цвет
МЕТОД БУРРИ
Является негативным методом окраски: окрашивается фон, а не сами микроорганизмы. Для этого используют красители, не окрашивающие бактерии, например тушь
МЕТОД БУРРИ-ГИНСА
Используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бурри
МЕТОД МОРОЗОВА
Предназначен для обнаружения путём импрегнации серебром вирусов, а также выявления микроструктуры бактерий (в том числе риккетсий, спирохет), жгутиков, аргирофильных и аргентофильных включений и гранул. Принцип метода состоит в том, что при обработке аммиачным раствором серебра эта соль восстанавливается в исследуемом объекте и специфические ингредиенты объекта избирательно окрашиваются в коричневато-чёрный цвет
РЕЦЕПТ УСПЕШНОГО ОКРАШИВАНИЯ

МЕТОД ГРАМА
  1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором генцианового фиолетового в течение 1-2 минут
  2. В течение 1 минуты обрабатывают мазок раствором Люголя
  3. Обесцвечивают спиртом 10-20 сек.
  4. Промывают водой
  5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1-2 минуты

NB! Грамположительные бактерии - фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии - розовый цвет


МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСОНА

  1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин
  2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин
  3. Промывают водой
  4. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель)

NB! Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые - в сине-голубой


МЕТОД РОМАНОВСКОГО-ГИМЗЕ

  1. Мазки, акцентируют в метиловом спирте
  2. Окрашивают на протяжении 40-120 минут раствором, в состав которого входят 1 мл приготовленной краски жидкой формы, 2 мл главного буферного раствора и 47 мл дистиллированной воды

NB! При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый


МЕТОД ОЖЕШКО

  1. Предварительно нефиксированный мазок протравливают 0,5% раствором соляной кислоты при подогревании на пламени горелки
  2. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин
  3. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин
  4. Промывают водой
  5. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель)

NB! Цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный


МЕТОД НЕЙССЕРА

  1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску
  2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 сек
  3. Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.
  4. Промывают водой, высушивают

NB! Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет


МЕТОД БУРРИ

  1. Каплю исследуемой культуры смешивают на предметном стекле с каплей специально приготовленной чертёжной туши
  2. Затем другим стеклом делают тонкий мазок, высушивают его на воздухе и микроскопируют, применяя иммерсионное масло

NB! На темном фоне видны неокрашенные микроорганизмы


МЕТОД БУРРИ-ГИНСА

  1. Черную тушь смешивают в культурой и высушивают
  2. После этого проводят фиксацию в пламени горелки
  3. Окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты
  4. Промывают водой 5-10 секунд

NB! В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов


МЕТОД МОРОЗОВА

  1. Готовый микробиологический мазок окрашивают аммиачным раствором серебра
  2. Микроскопируют

NB! Капсиды вирионов не окрашиваются и наблюдаются в виде светлого ободка, фон препарата — бесцветный или желтоватый

КОНЕЦ!
В заключении хочется подчеркнуть важность правильного выбора метода окрашивания для получения достоверных результатов исследования. Различные методы окраски,такие как позитивные, негативные и сложные, позволяютдифференцировать микробы, определять структурные деталимикробных клеток и выявлять специфические компоненты, такие каккапсулы, споры и включения. Использование качественныхматериалов, соблюдение правил приготовления мазков иприменение современных методик окрашивания обеспечиваютточность и информативность микробиологических исследований